Бібліотеки готують фрагментація зразка гДНК або кДНК і лігування спеціалізованих адаптерів до обох кінців фрагмента. Ці адаптери містять повний набір сайтів гібридизації праймерів секвенування. Це усуває потребу в додаткових етапах ПЛР, роблячи процес повністю автоматизованим.
Найшвидший і найпростіший спосіб створити високоякісні бібліотеки РНК — це використовувати набір для підготовки бібліотек NEBNext UltraExpress RNA (NEB #E3330). З a 3-годинний робочий процес, у поєднанні з наборами для збагачення полі(А) мРНК або наборів для деплеції рРНК ви можете перейти від загальної РНК до високоякісних спрямованих бібліотек за один день.
Крок №2: Підготовка бібліотеки Це робиться фрагментація цільових послідовностей до бажаної довжини з наступним приєднанням специфічних адаптерних послідовностей до кінця цих цільових фрагментів. Адаптери можуть також містити штрих-код, який ідентифікує конкретні зразки та дозволяє мультиплексування.
Загальна ланцюгова РНК Illumina TruSeq: кількість Від 100 до 1000 нг загальної РНК в об'ємі 10-15 мкл рекомендовано для створення бібліотеки за допомогою набору Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero.
Основні етапи експерименту RNA-seq включають: Екстракція РНК, фрагментація РНК, генерація кДНК, ампліфікація бібліотеки та секвенування на платформі NGS, щоб отримати рядки даних безперервної послідовності в «читаннях».
Розмір бібліотеки Секвенована РНК називається бібліотекою РНК. З більшою довжиною зчитування та більш точною послідовністю, сьогодні в більшості організмів більшість зчитувань картується. Розмір бібліотеки може означати одну з двох речей: загальна кількість зчитувань, які були секвеновані під час циклу, або загальна кількість зіставлених зчитувань.